卵巢子宫内膜异位症的输卵管上皮细胞起源研究

【摘要】背景和目的：子宫内膜异位症是一种常见的妇科良性疾病,它是子宫内膜组织在子宫腔以外的部位生长而引起的疾病,卵巢是最常受累的器官。异位内膜组织由子宫内膜样腺体和间质组成,具有功能活性,在局部呈浸润性生长和反复出血,引起相应的组织学改变和临床症状,患者通常表现为慢性盆腔痛,性交痛,出现月经异常,甚至造成不孕症。据统计大约有10%的育龄期女性会罹患子宫内膜异位症,并且高达50%的子宫内膜异位症患者因此正遭受慢性腹痛和不孕症的折磨。尽管100多年前CarlvonRokitansky医生首次辨明并详细记载了子宫内膜异位症,从此人们对该病开始有所认识并为之进行了许多开拓性研究,但是到目前为止,人们对子宫内膜异位症的发病机制还不是十分清楚。目前关于子宫内膜异位症的发生学说,为大家所普遍接受的是被称为“子宫内膜异位症之父”的Sampson医生于20世纪20年代提出的经血逆流种植学说。但是该学说依然存在许多矛盾的地方,比如有将近90%的育龄期女性存在经血逆流的现象,然而只有5%～10%的育龄期女性发现患有子宫内膜异位症。经血逆流学说可以用来解释发生在盆腹腔内的子宫内膜异位症,但是该学说尚不能解释出现在腹腔以外的子宫内膜异位症。经血逆流学说的这些矛盾之处使得Iwanoff及同时期的Meyer医生提出的体腔上皮化生学说找到了用武之地,体腔上皮化生学说的核心是认为子宫内膜异位症是由间皮细胞经过化生过程转化而来。在腹腔以外的远隔部位发生的子宫内膜异位症以及在男性人群中鲜见的子宫内膜异位症则支持这种理论学说。尽管体腔上皮化生学说能够圆满解释大多数的卵巢上及腹腔内的子宫内膜异位症,但是该学说缺少细胞或者分子水平的证据支持。与此同时,子宫内膜碎片经淋巴管道以及血管途径转移到远处也被视作为子宫内膜异位症发生的一个补充理论,它常常能够用来解释出现在远离盆腔的罕见部位出现的子宫内膜异位症,但是该理论尚不能作为子宫内膜异位症播散种植的主要发生机制。近年来兴起的干细胞学说则认为来源于骨髓的干细胞可以在盆腔内外分化成为子宫内膜样组织,然而这个干细胞理论毕竟是刚刚起步,尚未完全清晰明了。综上所述,目前为止尚无单一理论学说能够完美的解释任何位置的子宫内膜异位症的发病机制。许多年以来,女性输卵管仅仅被视为含子宫内膜碎片的经血逆流进入盆腔以及输送卵子及受精卵进入子宫腔着床的一个肌性通道。人们从来没有怀疑输卵管可能会是子宫内膜异位症的一种重要的组织细胞起源。我们在临床上通过对大量病患的输卵管病理切片的检视,发现输卵管可能在某种程度上参与了卵巢子宫内膜异位症的形成。我们经常能在行输卵管结扎术的组织标本的在靠近宫腔一侧的输卵管管腔中发现输卵管粘膜上皮子宫内膜样变,并且我们目前发现输卵管的粘膜上皮能够形成子宫内膜样的组织。许多能存活的上皮细胞能够从输卵管粘膜脱落下来在卵巢表面形成输卵管内膜异位(endosalpingiosis)或者称为卵巢表面上皮包涵体,在大约30%的病例中能够发现这种包涵体。近来我们在关于卵巢低级别浆液性癌的细胞起源的研究中发现大部分卵巢表面上皮包涵体来源于输卵管粘膜上皮,此种卵巢包涵体很可能通过化生过程转化为卵巢子宫内膜异位症。基于以上各种学说以及临床病理发现,我们大胆推测输卵管粘膜上皮参与了卵巢子宫内膜异位症形成。为了验证我们的推测,必须找到一些特异性的生物标记物,能够将卵巢子宫内膜异位症区分出是输卵管细胞起源还是来源于子宫内膜。因此在本研究中,我们通过全基因组表达谱芯片技术筛选出一系列在输卵管粘膜上皮和在子宫内膜组织中存在明显的差异表达的基因,而后在卵巢子宫内膜异位症组织中分析筛选出的差异基因的表达状况并与配对的输卵管粘膜上皮及子宫内膜组织中的该基因的表达状况进行比较,来判断卵巢子宫内膜异位症的细胞起源。材料与方法：收集山东大学齐鲁医院妇科2010年至2013年期间56例住院患者的共147例标本。研究对象因卵巢子宫内膜异位症或其他妇科良性疾病行全子宫加双侧附件切除术。其中35例患者患有卵巢子宫内膜异位症,术后获得输卵管伞,配对子宫内膜及卵巢子宫内膜异位症组织。21例患者无子宫内膜异位症,术后获得输卵管伞及配对子宫内膜。组织标本取得后切成小块液氮速冻或经10%中性福尔马林固定后包埋便于组织学鉴别及研究。包含上皮组织和间质的卵巢子宫内膜异位症病灶组织,输卵管粘膜上皮及相应子宫内膜经显微镜下行微切割,留待后续的实时定量PCR或Westernblot蛋白印迹实验。从21例非卵巢子宫内膜异位症患者组织标本中取3对配对的新鲜输卵管伞及子宫内膜组织,进行全基因组表达谱芯片实验并分析找出组织特异性的标记物。基因筛选标准：在两种组织中该基因的表达差异大于2倍且p<0.05。根据芯片结果及筛选标准,选定目的基因：FMO3和DMBTl,并在21例非卵巢子宫内膜异位症患者组织标本中通过实时定量PCR进行进一步验证。利用实时定量PCR分析35例卵巢子宫内膜异位症患者输卵管伞,子宫内膜以及卵巢内异症病灶三处组织中的目的基因表达状况。利用WesternBlot蛋白印迹实验在蛋白水平上分析上述组织标本中FM03和DMBTl的表达状况。利用免疫组化技术分析FM03和DMBTl在输卵管伞,子宫内膜和卵巢子宫内膜异位症组织切片中的表达分布状况。结果：1.全基因组表达谱芯片分析发现多种差异表达基因在输卵管与子宫内膜中分别有4114个和3451个基因存在差异表达,共有1796个基因表达差异倍数在2倍以上。与子宫内膜比较,输卵管中共有911个上调2倍以上的基因,包括8个50倍以上的基因,28个20倍以上的基因,及875个2倍以上的基因。与输卵管伞比较,子宫内膜中共有885个上调2倍以上的基因,包括7个20倍及以上的基因,878个2倍及以上的基因,尚无上调50倍以上的基因。2.FM03基因在输卵管伞中高表达,而DMBT1基因在子宫内膜中高表达实时定量PCR实验证实21例非卵巢子宫内膜异位症患者配对的输卵管和子宫内膜组织中2种基因的表达状况：FM03在输卵管中高表达(平均上调倍数44.38,p<0.001),而DMBT1在子宫内膜中高表达(平均上调倍数22.11,p＜0.001)。Westernblot蛋白印迹实验显示FM03在输卵管伞中高表达(平均上调倍数11.05,p=0.006),而DMBT1在输卵管伞中低表达(平均下调倍数32.08,p=0.001)。免疫组化显示FM03和DMBT1为细胞浆着色。多数输卵管上皮细胞呈现FM03中等或强阳性染色。21例子宫内膜组织腺体细胞呈弥漫性DMBT1强阳性染色,输卵管上皮细胞尚未见DMBT1阳性染色。3.FM03及DMBT1在卵巢子宫内膜异位症组织中的表达FM03及DMBT1在35例卵巢子宫内膜异位症患者的输卵管伞和子宫内膜组织中在基因转录水平及蛋白水平的表达趋势与非卵巢子宫内膜异位症患者一致。有32例患者三处组织标本均可用于实时定量PCR分析,与对应的子宫内膜比较,其中18例卵巢子宫内膜异位症组织FM03表达上调,平均上调倍数7.21倍(p=0.016)；与对应的输卵管伞比较,14例卵巢子宫内膜异位症组织标本中FM03表达明显下调,但是与对应的子宫内膜组织比较,没有统计学差异。在18例上调表达FM03的卵巢子宫内膜异位症组织标本中,与对应的子宫内膜组织比较,其DMBT1的表达明显下调,平均下调倍数6.94(p=0.022)；但是与对应输卵管伞比较,没有统计学差异(p=0.144)。Westernblot蛋白印迹实验显示上述18例上调表达FM03同时下调表达DMBT1的卵巢子宫内膜异位症组织中FM03及DMBT1蛋白表达趋势同mRNA水平表达趋势,其中FM03蛋白表达平均上调7.2倍。剩余17例卵巢子宫内膜异位症组织标本Westernblot蛋白印迹实验分析显示8例与子宫内膜中具有相似的FM03蛋白表达水平,9例与对应子宫内膜中该蛋白表达水平无统计学差异。19例卵巢子宫内膜异位症患者三处组织Westernblot蛋白印迹实验显示DMBT1蛋白在卵巢子宫内膜异位症组织中的表达状况与在输卵管伞中表达状况相似,无统计学差异,但子宫内膜组织DMBT1蛋白表达明显上调。剩余16例卵巢子宫内膜异位症患者中,与输卵管伞比较,DMBT1蛋白在卵巢子宫内膜异位症组织中表达上调,其中有12例上调表达显著,另有4例卵巢子宫内膜异位症组织与对应子宫内膜比较没有显示表达差异。35例卵巢子宫内膜异位症组织免疫组化显示,19例子宫内膜异位症上皮细胞的胞浆呈FM03中等阳性染色,剩余16例有10例局灶性阳性着色,6例因上皮组织缺如无法着色。有17例卵巢子宫内膜异位症组织切片呈现DMBT1染色阴性,剩余18例其中10例卵巢子宫内膜异位症阳性染色。结论：近60%的卵巢子宫内膜异位症病例其子宫内膜异位症病灶组织细胞可能起源于输卵管上皮细胞,40%的卵巢子宫内膜异位症病例的子宫内膜异位症病灶组织细胞可能源自子宫内膜细胞。输卵管上皮细胞是卵巢子宫内膜异位症的一种潜在的组织细胞起源。
【作者】袁增；
【导师】孔北华；郑文新；
【作者基本信息】山东大学，妇产科学，2014，博士
【关键词】卵巢子宫内膜异位症；输卵管；子宫内膜；标记物；

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